粉象提现时间-为什么粉象提现不了

简单的说：

溶液一：重悬菌体，提供缓冲环境。

溶液二：氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放细胞内的质粒。

溶液三：中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换，吸附菌体产生沉淀。

复杂的说：

让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的溶液，是再自然不过的了。那么50mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。

那么呢？大家知道是Ca2和Mg2等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10mM的，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有。

如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液II了。这是用新鲜的04N的和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓稀释制备04N的，无非是为了保证没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

事实上是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从（双层膜）结构向（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。

很多人对的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。

基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。

如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5N的，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。

这其实是十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾，而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所。

产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。

所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。

溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，。

因此要用酚氯仿异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的而发生降解。这里用的酚氯仿异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。

酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。

至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。

如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。

碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。

非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。这里暂不深究。想说的，终于说完了。谢谢你的耐心。留下一个思考题，为什么真核生物的基因组DNA不能用碱法抽提？。

与平台无关，与个人能力更有关。

看你卖什么东西的。

应该是经营方式问题

多客拼团快

其实差不多

选无痕团队，社群做的不错值得一看，百度直接搜索粉象生活实战家无痕。从0开始学习。我现在就在一点一点学习效果不错。

首先我想告诉你，粉象生活和贝店还是有很大的本质区别的。目前来说，个人觉得粉象生活会好很多，比较容易上手，因为网购人群的占比是很大的，使用以后可以省钱这么好的事情没有理由拒绝的。邀请码。

就粉象生活的话，输入验证码T8K5Y4就能下载注册了。

与平台无关，与个人能力更有关。

看你卖什么东西的。

应该是经营方式问题

多客拼团快

其实差不多

在这个项目泛滥的时期，很多人都会说，又是一个骗钱的，本人一直从事互联网方面，也是辛苦，后来接触一些形形色色的项目，层出不穷，你能来百度，相信你也是从旁人提到粉象生活这个新零售平台，那么，我来直观的告诉你，粉象生活是什么！！

粉象生活是一个汇聚全网内部优惠券的导购性的APP，通常我们购物一般都会选择，比如，天猫，淘宝，京东，唯品汇，拼多多等等。生活中，你出门会用滴滴打车，摩拜。午餐的时候会选择，肯德基、麦当劳。在家的时候，会用到，饿了么，美团，甚至出门时需要，订酒店，机票，景点门票等等。而粉象生活是将这些项级的平台商家整合起来，发放内部的隐藏的大额优惠券，打折卡，返佣金。是我们平时在逛淘宝天猫的时候看不到，领不到的，内部券是一种无门槛的优惠券，只要领券下单直接立减，数量有限，抢完为止，优惠力度大。

在日常生活中，我们每个人都离不开的是消费，有没有计算过你自己一个人的衣食住行所有的开销呢，每天都在消费，这是一个庞大的数据，那么我们的日常消费与粉象生活有什么直接关系呢？同时，还能帮助我们什么？

对比（在淘宝 京东天猫，同一家店、同一个商品，但是价格却不同）

看到了吗，在这样强大的粉象生活APP中，在领优惠券的同时，还可以返佣金，这样一年省一个没有问题。

而且，自购省钱的同时，也可以分享赚钱，不需要投入一分钱，真正的0投资，0成本，0门槛，0囤货，0发货，0风险。并且还会给予推广分享的粉象生活的VIP和合伙人们增加管理津贴的奖励政策！真正实现：自购省钱，分享赚钱，管理津贴，公司分红四大部分奖金！这是任何一家平台都无法比拟和替代的。